کیتین: پلیمر طبیعی،‌درمانگر زخم

کیتین، فراوان‌ترین پلیمر طبیعی بعد از سلولز است. پلی ساکارید ازت داری است که ، در آن گلوکز،آمونیاک و اسید استیک به صورت مولکولهای گلوکز آمین وجود دارد.
کیتین، ماده خام فراوانی است که ، توسط سلول‌های زنده گیاهی و جانوری ساخته می‌شود، و برای تبدیل به مواد شیمیایی و محصولات جدید عملا تمام نشدنی است. این نوع مواد زیستی به علت برتری‌ها و مزیت‌های طبیعی و ذاتی،آینده درخشانی دارند. کیتین ماده با ارزشی است که، استفاده‌های صنعتی، شیمیایی، پزشکی، دارویی ،آرایشی و بهداشتی دارد.

در مجاورت محلول سدیم هیدروکسید غلیظ و گرما گروه‌های استیل آمینو کیتین(ACNH-) به عاملهای آمینی (-NH2) تبدیل می‌شوند. به این طریق می‌توان گفت از فرم دی استیله شده کیتین،ترکیبات مختلف کیتوسان را تهیه می‌شود.
منابع تولید کننده کیتین و کیتوسان عبارتند از: میگو، خرچنگ، لابستر، کریل، صدفهای دو کفه ای، ماهی مرکب، اسکوئید،کلم، مرجانهای آب شیرین، دیاتومه، جلبکها، حشرات و قارچ ها.
کیتین و کیتوسان تعدادی خواص بیولوژیک مفیدی مانند زیست سازگاری بالا و قابلیت زیست تخریب پذیری در کاربرد هایی نظیر : پوشش زخم ها، عامل‌های انعقاد خون، عامل‌های ضد عفونت و عامل‌های تسریع در ترمیم زخم دارند.
در این تحقیق اثر کیتین و کیتوسان روی ترمیم زخم بررسی شده و این نتیجه حاصل شده است، که این مواد سیستم‌های ترمیم و سلول‌های (PMN) Polymorphonuclear و فیبروبلاست‌ها و سلول‌های اندوتلیال رگ‌ها را فعال می‌کنند.
وقتی کیتین و کیتوسان در بدن استفاده می‌شوند، توسط آنزیم‌های کیتیناز و کیتوساناز تخریب می‌شوند و متعاقبا به منومر و الیگومرهایشان تبدیل می‌شوند. در تحقیقات گذشته ثابت شده که نه تنها کیتین و کیتوسان بلکه الیگومرها و منومرهای آنها نیز روی مهاجرت سلول‌های اندوتلیال و فیبروبلاست‌ها اثر داشته  و بر روی ترمیم زخم‌ها در محیط in-vivo موثرند. هر چند که رابطة بین خواص شیمیایی کیتین/کیتوسان و ترمیم زخم هنوز شناخته نشده است. در تحقیق حاضر کیتین و کیتوسان با وزن‌های مولکولی و DD‌های مختلف آماده شده اند و اثر آنها روی ترمیم زخم‌های برشی ایجاد شده در موشها آزمایش شده،  و همچنین استحکام زخم ترمیم شده و میزان آنزیم کلاژناز در بافت هم اندازه گیری شده است، که این دو به عنوان شاخصی برای ترمیم زخم هستند.

آزمایشات
مواد استفاده شده
در این پژوهش از منومر کیتین(Gl¬c¬NA c¬)، الیگومر کیتین (NACOS) و پلیمر کیتین و همچنین از منومر کیتوسان (Gl¬c¬N)، الیگومر کیتوسان  (COS)و پلیمر کیتوسان استفاده شد.
کیتین ( باوزن مولکولی 300KD ) و کیتوسان ( با وزن مولکولی 80KD ) با میانگین سایز 5/3 میکرو متر به وسیله گاز اتیلن اکساید استریل شدند و  در محلول بافر فسفات ( PBS با PH=7/2  ) با غلظت 10 میلی گرم بر میلی  لیتر معلق می‌شوند. کیتین و کیتوسان به ترتیب شامل DD‌های کمتر از 10 درصد و بیشتر از 80 درصد هستند .
الیگومرها و منومرها در محلول PBS با غلظت 10 میلی گرم بر میلی لیتر حل شدند و از فیلترهای با روزنه‌های 45/0 میکرو متر عبور کرده و استریل شدند، و سپس نمونه‌ها در 3 غلظت، 1/0، 1 و 10 میلی گرم بر میلی لیتر با PBS تنظیم شدند.
چهار نمونه مختلف دی استیله شده کیتین (DAC) ( با 14% و 23% و 63% و 96% ) با یک وزن مولکولی یکسان (50KD) تهیه شد و به صورت پودری با میانگین سایز 6 تا 8 میکرومتر استریل شده و به همان روش تنظیم کیتین و کیتوسان تنظیم شده‌اند، پودر‌ها با DD 100% رابا (DAC100) نشان می‌دهند.
وزن مولکولی در این تحقیق توسط روش viscosity و  DDهم توسط روش IR و یا روش colloidal titration تعیین شده است.

طرح آزمایش
از 72 عدد موش ماده Wistar ( با وزنی حدود 300±20gr ) در این تحقیق استفاده شده است. پس از اینکه موهای پشت موشها تراشیده و قسمت تراشیده شده با (یدI ) ضد عفونی شد، 2 زخم برشی ضخامت کامل (با طول 4 سانتی متر ) در حالت  بی هوشی با چاقوی جراحی روی پشت موش‌ها ایجاد می‌شود. پس از اینکه خونریزی متوقف شده  با 100 میکرولیتر از هر نمونه زخم شتسشو داده می‌شود و سپس زخم با بخیه هایی از جنس Stainless Steel بخیه می‌شوند .  هفت روز بعد از جراحی حیوانات اتانازی (کشته) می‌شوند و از بافت پوست در محل زخم نمونه برداری می‌شود. در بررسی استحکام زخم بهبود‌یافته یک نوار از پوست ( با 1 سانتی متر عرض و 2 سانتی متر طول ) از وسط محل زخم در هر نمونه برداشته می‌شود. حداکثر استحکام تا زمانی که پوست از محل برش پاره شود،  با loud gauge و کشش‌سنج اندازه‌گیری  شد.
اطلاعات به دست  آمده به سطح مؤثر تقسیم  شده ( 5 میلی متر از خط برش در هر نمونه ) و در آخر بر حسب نیوتن بر میلی متر مربع بیان شده (N/mm2) ، در دیگر نمونه‌ها ( نمونه‌های دوم ) میزان آنزیم کلاژناز با دستگاه اندازه گیری کلاژن نوع I اندازه گرفته شد و مشاهدات بافت شناسی نیز انجام گرفت.
تحلیل‌ها
اثر وزن مولکولی روی استحکام بهبود‌یافته و فعالیت  آنزیم  کلاژناز
اثر وزن مولکولی روی استحکام زخم بهبود  یافته در شکل 1 نشان  داده شده است .

استحکام زخم بهبود یافته در همة نمونه‌ها افزایش قابل توجه ای در مقایسه بانمونة شاهد (Saline) داشت. در گروه کیتین ( شامل : کیتین،GlCNAc ،  NACOS) و کیتوسان ( شامل :‌ کیتوسان  و GLCN  ، COS ) بیشترین تأثیر مربوط به الیگومر‌ها (NACOS , COS)  بود. وقتی گروههای کیتین  و گروههای کتیوسان با هم مقایسه شدند، مشخص شد، که گروههای کیتوسان در یک وزن مولکولی یکسان اثر بیشتری از گروههای کیتین دارند، و همچنین اثر غلظت mg1/0 از بقیه غلظت‌ها برای هر کدام از نمونه‌ها بیشتر بود.
 اثر وزن مولکولی روی فعالیت  آنزیم کلاژناز در شکل 2 نشان داده شده است.

فعالیت آنزیم کلاژناز در همة  نمونه‌ها افزایش قابل توجه ای را در مقایسه با نمونه شاهد نشان داد و در گروههای کیتوسان منومرGLCN بیشترین تاثیر را داشت، در حالیکه در گروه‌های کیتین اختلاف زیادی وجود نداشت.
فعالیت آنزیم کلاژناز در گروه‌های کیتوسان بیشتر از گروه‌های کیتین است. اختلاف زیادی بین فعالیت آنزیم کلاژناز در غلظت‌های مختلف نمونه‌ها وجود نداشت ولی این میزان برای غلظت mg 1 کمی بیشتر از سایر غلظت‌ها بود.
در یافته‌های بافت شناسی مشخص شد، که در گروه‌های کیتوسان نسبت به گروه‌های کیتین فیبرو بلاست‌های بیشتری در اطراف زخم بودند و فیبرهای کلاژنی در الیگومرها(NACOS,COS)به صورت عمود بر خط برش رشد کردند(شکل 3)، در حالیکه در نمونه شاهد و منومرها(,GLCNAC GLCN) این فیبرها به صورت موازی با خط برش رشد کردند(شکل 4).
این تحقیق نشان می‌دهد، که نه تنها کیتین و کیتوسان بلکه منومرها والیگومرهای آنها نیز سرعت ترمیم زخم را افزایش می‌دهند، هر چند که این قضیه کاملا آشکار نیست. به هر صورت کیتین و کیتوسان به علت اینکه به وسیله برخی از آنزیم‌ها در محیط زخم به مونومرها و الیگومرهایشان تخریب می‌شوند، مستقیما در ترمیم زخم اثر گذارند، و در این تحقیق ثابت شده که الیگومرها تأثیر بیشتری دارند.
نمی توان به درستی توضیح داد، که چرا الیگومرها اثر بیشتری بر روی ترمیم زخم دارند . با وجود این یک جواب مطرح است: نمونه با سایز مولکولی مختلف در زخم استفاده شده و درجه تخریب برای هر نمونه متفاوت است، بنابراین در پلیمر کیتین و کیتوسان زمان بیشتری برای تخریب و جذب در زخم به علت وزن مولکولی بالا لازم است. در حالیکه منومرها به علت وزن مولکولی کم به سرعت جذب می‌شوند، به علاوه الیگومرها هم از این جهت مناسب هستند.
نه فقط کیتین و کیتوسان بلکه الیگومرها و منومرهایشان هم فعالیت آنزیم کلاژناز را افزایش می‌دهند. فعالیت آنزیم کلاژناز با تغییر شکل زخم در طی فرآیند ترمیم زخم رابطه دارد. این آنزیم به طور عمده توسط فیبروبلاست‌ها و سلول‌های التهابی تولید می‌شود. در مشاهدات بافت شناسی فیبروبلاست‌های بیشتر و سلول‌های التهابی کمتری در اطراف زخم دیده شده که نشان دهنده این است، که فیبروبلاست‌ها به طور عمده آنزیم کلاژناز را تولید می‌کنند. این پدیده به این معنی است، که کیتین و کیتوسان و مواد حاصل از تخریب آنها بر روی شکل زخم در طی فرآیند ترمیم زخم تاثیر می‌گذارند. تحقیقاتی کلینیکی وجود دارد، که نشان می‌دهد که جای زخم در حضور کیتین و کیتوسان به حداقل میزان خود می‌رسد.
در این تحقیق رنج غلظت همه نمونه‌ها از 1/0 تا 10 میلی گرم بر میلی لیتر، باعث افزایش سرعت ترمیم زخم شده و فعالیت آنزیم کلاژناز را نیز افزایش داده است.
از نمونه‌ها با میزان غلظت  1/0 تا 10 میلی گرم بر میلی لیتر استفاده شده و 1/0 میلی لیتر از هر نمونه روی زخم‌ها قرار داده شد، (4 سانتر متر * 1 سانتی متر سطح زخم) کمترین وزن هر نمونه 01/0 میلی گرم (10 میکروگرم) است. با توجه به اینکه همه غلظت‌ها برای تسریع در بهبود زخم کافی هستند بنابراین برای بدست آوردن حداقل غلظت موثر باید اثر غلظت‌های کمتر هم بررسی شود.

اثر DD روی استحکام زخم‌های بهبود‌یافته و فعالیت کلاژناز
جدول 1 اثر DD را روی استحکام زخم‌های بهبود‌یافته و فعالیت کلاژناز را نشان می‌دهد.
 
مقدار هر دو پارامتر در همه نمونه‌ها افزایش قابل توجه ای نسبت به نمونه شاهد دارد.
هرچهDD بیشتر باشد، استحکام زخم بهبود‌یافته و فعالیت آنزیم کلاژناز بیشتر است، و همچنین در مطالعات بافت شناسی درDD‌های بالا فیبروبلاست‌های فعال شده بیشتری مشاهده شده است(شکل 5 و 6)
شکل 5 و 6

نتیجه گیری:‌
نتیجة این تحقیق با تحقیقات گذشته سازگار است. علاوه بر کیتین و کیتوسان  منومرها و الیگومرهای آنها هم فرآیند ترمیم زخم را تسریع می‌کنند . استحکام زخم بهبود‌یافته و فعالیت  آنزیم  کلاژناز در گروههای کیتوسان بیشتر از گروههای کیتین است.
در مطالعات بافت شناسی مشخص شد که کلاژن در جهت عمود بر خط برش در گروههای الیگوساکارید (NACOS,CAS) رشد کرده و تعدادی فیبروبلاست‌های فعال  شده در اطراف زخم در گروههای کیتوسان نشان داده شد.
و در مورد درجه دی استیله شدن، هرچه این درجه بالاتر باشد استحکام زخم بهبود‌یافته و فعالیت فیبرو بلاست‌ها افزایش بیشتری را نشان می‌دهند.
شکل 1) اثر وزن مولکولی روی استحکام زخم بهبودیافته